Клиническая химия: анализ цереброспинальной жидкости

Ликвор – это спинномозговая жидкость, которая заполняет и омывает анатомические пространства головного и спинного мозга. Несет в себе важнейшие функции по защите этих органов от повреждений и сотрясений, помогает сохранить постоянство жидких сред, поддерживает внутричерепное давление. Помимо этого, участвует в выделении метаболитов мозга, транспортировке питательных веществ. Анализ ликвора помогает выявить патологии ЦНС, их степень и развитие, поскольку спинномозговая жидкость немедленно реагирует изменением параметров на любые перемены в мозге.

Показания к назначению

Исследование ликвора проводится при:

• появлении риска кровоизлияния в полости мозга;
• инфекциях, поражающих центральную нервную систему и приводящих к воспалению оболочек (менингит, энцефалит, менингоэнцефалит);
• злокачественных образованиях в мозговой оболочке;
• наличии подозрения на ликворею (потерю спинномозговой жидкости), основной причиной которой является нарушение целостности твердых оболочек мозга.

Вышеназванные показания являются абсолютными, т. е. требующими обязательного проведения анализа ликвора. Исследование также может быть выбрано средством диагностики при других ситуациях. Такими относительными показаниями могут выступать:

• заболевания, вызванные демиелинизацией, т. е. разрушением миелиновой оболочки нейронов, при котором ухудшается проводимость нервного импульса и возникают различные отклонения (например, рассеянный склероз);
• аутоиммунные заболевания;
• закупорка сосудов патогенными организмами (септическая эмболия);
• наличие у ребенка лихорадки неустановленного происхождения;
• системные поражения периферических нервов (полиневропатия), вызванные воспалительными реакциями.

В некоторых случаях проведение анализа ликвора противопоказано, например, при новообразовании большого размера, сильно увеличенном черепном давлении, отеке.

С осторожностью назначают процедуру при нарушениях свертываемости крови (из-за риска развития кровотечений) или тромбоцитопении (понижении количества тромбоцитов, сопровождающемся кровоточивостью).

Исследование при рассеянном склерозе

Рассеянный склероз относится к неврологическим заболеваниям, чаще болеют женщины. Рассеянный склероз не всегда проявляется выраженными симптомами, нередко характеризуется неспецифическими признаками – онемением и покалыванием в конечностях, слабостью, быстрой утомляемостью. При рассеянном склерозе почти в 90% случаев в ликворе обнаруживают иммуноглобулины IgG, которые синтезируются в области повреждения миелиновой оболочки головного мозга. Олигоклональные IgG обнаруживаются при многих других заболеваниях нервной системы, для диагностики рассеянного склероза анализ ликвора проводят как дополнительное исследование, когда исследование на МРТ показало неоднозначные результаты. При рассеянном склерозе показатели электрофореза белков сыворотки крови нормальные, в то же время в ликворе обнаруживаются олигоклональные антитела. Для дифференцирования рассеянного склероза от других заболеваний проводят исследование определенных параметров ликвора – количества и состава клеток, уровня белка. При рассеянном склерозе уровень повышения белка будет умеренный. Анализ ликвора для диагностики рассеянного склероза назначается при появлении симптомов заболевания:

• учащение мочеиспускания.
• онемение и покалывание в конечностях.
• двоение в глазах.
• слабость, быстрая утомляемость.
• нарушение координации при движении.

Методы исследования ликвора

Спинномозговую жидкость собирают в несколько пробирок, так как методика исследования ликвора предполагает проведение анализов:

• клинического (внешнего и внутреннего);
• биохимического;
• бактериологического.

Внешний анализ подразумевает изучение вида спинномозговой жидкости, ее цвета, прозрачности, наличия фибринозной пленки, которая образуется при высокой концентрации белка фибриногена, отвечающего за свертываемость крови.

При микроскопическом (внутреннем) исследовании анализируется клеточный состав. В норме в ликворе имеются лишь моноциты и лимфоциты, при патологиях появляются другие клетки. Определяется их число в единице объема и проводится дифференциация.

При биохимическом анализе оценивается кислотность ликвора, его относительная плотность, наличие белка, уровень PH. Также определяется концентрация глюкозы, количество и пропорции лактата (молочной кислоты) и пирувата (пировиноградной кислоты). Это помогает в диагностике инфекций ЦНС – вирусных и бактериальных, а также может указывать на нарушение мозгового кровообращения.

Бактериологический способ исследования ликвора помогает выявить возбудителей заболеваний, таких, как пневмококк, менингококк, гемофильная, туберкулезная палочки. Он подразумевает взятие мазка, выделение и идентификацию вредоносного агента с определением антигенов.

Клиническая химия: анализ цереброспинальной жидкости

Каждый, кто смотрел еще со школьной скамьи сериал про гениального доктора Хауса, помнит сцены, где начинающий диагност доктор Чейз делает пациенту люмбальную пункцию, а последний лежит на боку, корчится от боли, но тем не менее ведет с врачом оживленную беседу. Откровенно нужно признать, что эту процедуру из вас, будущих выпускников, делать будет не каждый, но уметь читать результаты таких анализов – необходимый навык каждого врача. Чаще всего ликвор отправляют на анализ для диагностики и контроля развития воспалительных процессов, новообразований, а также других повреждений ЦНС. Важным элементом диагностики заболеваний ЦНС является анамнез. До начала пункции необходимо убедиться, что внутричерепное давление не повышено. В норме цереброспинальная жидкость прозрачна и чиста. Иногда может наблюдаться помутнение из-за большого числа лейкоцитов. 100-300 клеток в микролитре жидкости вызывает слабое помутнение раствора, 2000 – 10 000 – уже приводит к тому, что раствор перестает быть прозрачным.

Не надо устраивать панику, если в ликворе обнаруживается кровь. Это не обязательно является признаком того, что у пациента субарахноидальное кровотечение или вентрикулярные геморрагии. Быть может, вы попали в близлежащий сосуд. В случае кровотечения вся проба будет гомогенно красного цвета. В случае же попадания в сосуд по мере продвижения иглы проба будет постепенно становиться всё менее прозрачной. Чтобы различить старые и новые кровотечения, ликвор центрифугируют, в результате чего свежие, интактные эритроциты оседают на дне сосуда. Если же верхняя фаза так и осталась красного цвета, пробу дальше не исследуют, так как все результаты будут ложными. Кровь содержит намного больше клеток и белков. Поэтому нет смысла анализировать даже слегка алые пробы. Этот факт часто приводит к спорам между сотрудниками лаборатории и лечащими врачами. Часто врачи просят всё же проанализировать пробу, исходя из расчета 1000 эритроцитов на 1 лейкоцит. Тем не менее эти результаты из-за частичного гемолиза при изъятии пробы дальше исследовать нельзя — очень уж велик риск ошибочных результатов. Поэтому рекомендуем всем, кто в будущем будет проводить люмбальную пункцию, делать это с самого начала правильно (это лучше, чем еще раз приходить к пациенту и сознаваться, что «неправильно уколол» и просить об еще одной попытке). Ликвор розового, красно-коричневого или желтого цвета может быть признаком ксантохромии (например, в результате разрушения эритроцитов уже спустя 2 часа после начала кровотечения), или же может говорить о гипербилирубинемии (билирубин в высоких концентрациях проходит через ГЭБ). Ксантохромия в результате разрушения гемоглобина начинается не менее чем через 3 дня после кровотечения. С помощью спектрометрических анализов возможно определить концентрацию свободного гемоглобина, метгемоглобина и билирубина. При воспалительных реакциях организма часто повышается концентрация фибриногена в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Если проба простоит более 24 часов, то можно наблюдать образование сети фибрина. Однако диагностическое значение этого феномена минимально.

Поговорим сперва о клетках в ликворе. ГЭБ состоит из клеток эндотелия капилляров и отростков астроцитов (tight junctions). Воспалительные процессы приводят к нарушению плотности этих контактов, что влечет за собой увеличение клеток в ЦСЖ. Важно помнить, что исследование должно проводиться не более чем через час после пункции, так как эритроциты распадаются и их содержимое смешивается с ликвором. Поэтому пробу даже запрещается хранить в холодильнике.

Количество клеток в ликворе считается с помощью тех же методов, что и в случае крови (например, с помощью камеры Фукса-Розенталя, или же определение количества лейкоцитов при разведении пробы с уксусной кислотой). Камера Фукса-Розенталя способна вместить объем 3,2 микролитра. Раньше результаты записывали в виде дроби, деленной на 2. Например, 5/3 клеток. Теперь же количество клеток пишется, исходя из концентрации на микролитр (в данном случае — 2 клетки в микролитре пробы). Опытные лаборанты умеют различать гранулоциты и лимфоциты, считая их на предметном стекле. Количество различных клеток обычно указывают в процентах от общего числа. Для определения количества лейкоцитов используют специальные цитоцентрифуги. Окраска клеток по Паппенгейму крайне важна для диагностики опухолевых заболеваний. Аппараты для подсчета клеток, конечно, тоже используются, но в ликворе можно найти гораздо меньше клеток, чем необходимо для них , поэтому чаще прибегают к подсчету вручную.

Показатели нормы на микролитр люмбальной пробы (для субокципитального или вентрикулярного ликвора показатели ниже):Новорожденные: лейкоциты <15, эритроциты <500. Взрослые: лейкоциты <5, эритроциты отсутствуют. Лимфоциты 60-80%, моноциты 40-15% от общего числа. Количество клеток, превышающих пять на микролитр, называют плеоцитозом. Наибольшее число клеток встречается при бактериальном менингите (до 20 000 в микролитре), в основном это гранулоциты. При правильной антибиотикотерапии количество клеток в ликворе резко снижается. При бактериальном и вирусном менингитах количество лейкоцитов в миллилитре ЦСЖ может достигать 1000. В подострой пролиферативной стадии заболевания количество лейкоцитов уменьшается, а количество лимфоцитов увеличивается. Во время фазы ремиссии чаще всего можно увидеть в ликворе моноциты и лимфоциты. После операций на головном мозге возможно увеличение всех трех типов клеток, что является признаком асептичного воспаление. В ранней фазе острых бактериальных и вирусных менингитов количество лейкоцитов не превышает 100 в микролитре пробы. Плохим прогностическим признаком в этот момент является большее количество бактерий по сравнению с увеличением количества лейкоцитов. Клетки опухолей чаще появляются в ликворе при различных метастазах. Клетки первичной опухоли обнаруживаются, если только само новообразование располагается неподалеку от ЦСЖ.

Так же как и в случае клеток, нарушение проницаемости ГЭБ приводит к повышению концентрации белков в ЦСЖ. На самом деле, чтобы быть более корректными, стоит говорить не о нарушениях проницаемости, а о нарушениях циркуляции ликвора. Именно последний фактор обуславливает его недостаточную фильтрацию при различных заболеваниях.

Для определения наличия альбумина используют специальные полоски, покрытые красителем, которые являются более чувствительными к альбумину, чем к глобулинам. В диагностике используют в том числе и метод Биурета, о котором шла речь в предыдущем посте, когда мы говорили о протеинах (до начала теста пробу обрабатывают перхлорной кислотой и трихлоруксусной кислотой). Также к количественным методам анализа относят турбидиметрическое исследование с трихлоруксусной кислотой с осаждением протеинов или пирогаллол красный молибдат.

Показатели нормы (мг/л):Новорожденные: 430 – 1030 мг/л Дети: 150-450 мг/л Взрослые: 200-400 мг/л Концентрация белков достигает высоких значений в первую очередь при менингитах бактериальной этиологии и может составлять 10 грамм в литре пробы; также она повышается в острой фазе других воспалительных заболеваний оболочек мозга, при нейроиммунологических патологиях, и при нарушении микроциркуляции ликвора (гиполикворея или аликворея).

Клетки головного мозга вырабатывают три диагностически значимых белка: NSE (нейронспецифическая енолаза), S-100 (димер, синтезируемый астроцитами) и Тау-белок (англ. Microtubule-associated protein tau, MAPT). Они попадают в спинномозговую жидкость через сосудистое сплетение желудочков мозга (plexus choroideus) или непосредственно через клетки эпендимы. Енолаза (NSE) и S-100 повышаются при внутримозговых кровотечениях и сотрясениях головного мозга, являются важными показателями для прогнозирования течения заболевания. Протеины Тау и фосфо-Тау встречаются при болезни Альцгеймера и болезни Кре́йтцфельдта — Я́коба. ГЭБ функционирует почти по тем же законам, чем фильтрационный барьер в почке: чем меньше протеин, тем проще он проходит через преграду. Поэтому преальбумин (молекулярная масса 61 килоДальтон) и альбумин (66 кДа) ещё имеют шансы преодолеть его, иммуноглобулину G (150 кД) это сделать куда труднее. Стоит напомнить, что альбумин синтезируется исключительно печенью, в то время как иммуноглобулины при воспалительных и опухолевых заболеваниях могут вырабатываться и в ЦНС.

Понятно, что для сравнения количества белка в ликворе нам понадобится и проба венозной крови. Именно поэтому всегда следует помнить, что забор венозной крови должен происходить до пункции. Если пациенту назначена иммуноглобулиновая или альбуминовая инфузионные терапии, то результаты теста тоже окажутся завышенными.

Стоит отметить, что анализ ликвора – не самая дешёвая процедура. Подобное исследование требует специального оборудования. С его помощью представляется возможным определить соотношение альбумина и IgG, IgA или IgM в ликворе по отношению к плазме (коэффициент Дельпеша). С помощью изоэлектрического фокусирования и гель-электрофореза с последующей окраской раствором, содержащим ионы серебра, возможно определение отдельных субклассов иммуноглобулинов в зависимости от количества в них каппа- и лямбда-цепей. Подобным же образом определяется наличие специфических антител к антигенам вирусов, например, к белкам вируса герпеса, краснухи и кори.

Вышеперечисленные методы вам, скорее всего, осваивать не придётся, разве что после цикла этих постов вы не влюбитесь в лабораторную диагностику. Более вероятно, что однажды вам принесут заключение анализа ликвора, а выглядеть оно будет в виде диаграммы Райбера. Сама диаграмма построена на исключительно эмпирических знаниях.

Исследуемый коэффициент сильно зависит от возраста пациента, поэтому для каждой возрастной группы необходимо определять своё значение нормы. При патологически увеличенном синтезе протеинов в ЦНС результат теста показывает нарастание олигоклональных антител. Олигоклональные антитела не встречаются в плазме крови; их также следует отличать от моноклональных, встречающихся при миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема и распространяющихся как в ликворе, так и в плазме крови. Олигоклональные антитела в 24-40% случаев встречаются при инфекциях ЦНС. Они играют большое значение в ранней диагностике рассеянного склероза. Наблюдается тенденция к распространению метода определения специфических антител в ликворе для дифференциальной диагностики различных неврологических заболеваний.

Другим важным диагностическим параметром является концентрация глюкозы и лактата в ЦСЖ. Глюкоза свободно проходит в мозг через ГЭБ с помощью специального транспортного белка. Низкая концентрация глюкозы в ликворе чаще всего говорит о том, что в нём содержатся бактерии, потребляющие его для поддержания своей жизнедеятельности. Вирусы же этого не делают. Клетки опухоли также отличаются особым аппетитом к глюкозе. Метаболизируя её, они в больших количествах образуют лактат. Эти два параметра (концентрация глюкозы и лактата в ликворе) используют в том числе для контроля последствий инсульта, в диагностике бактериальных и вирусных менингитов и менингоэнцефалитов. Этот тест должен быть проведен незамедлительно после забора пробы, поскольку концентрация лактата возрастает уже в течение первых 30 минут после забора ЦСЖ.

При остром бактериальном менингите концентрация глюкозы снижена, а уровень лактата особенно высок. С совокупности с клиническими симптомами эти изменения являются надежным доказательством диагноза. При острой фазе вирусного менингоэнцефалита оба параметра остаются неизменными. При антибактериальной терапии концентрация глюкозы резко увеличивается, а лактата уменьшается.

Тяжесть инсульта тоже коррелирует с концентрацией лактата в крови — при увеличении её более чем 4 ммоль в литре ЦСЖ можно говорить скорее о плохом прогнозе течения заболевания и большей области, затронутой ишемией. При генерализованных эпилептических припадках лактат увеличивается подобным же образом.

Источник

Klaus Dörner. Klinische Chemie und Hämatologie. 8 издание, Штуттгарт, 2013 год

Подготовка к обследованию

Подготовка к анализу ликвора заключается в следующем:

1. Берутся анализы крови (общий, на свертываемость).
2. На предварительной консультации собирается анамнез. Пациенту нужно сообщить врачу данные о перенесенных заболеваниях, наличии хронических недугов, негативных реакциях на медикаменты.
3. Сдавать спинномозговую жидкость необходимо натощак – за 12 часов до процедуры запрещается употребление пищи.

Перед обследованием не разрешен прием медикаментов, разжижающих кровь, а также анальгетиков и нестероидных противовоспалительных препаратов.

Норма, показатели ликвора у здорового человека

Помимо составляющих компонентов, прозрачности и цветовой характеристики, нормальный ликвор должен соответствовать и другим показателям: реакция среды, количество клеток, хлоридов, глюкозы, белка, максимальный цитоз, отсутствие антител и т.д.

Отклонение от приведенных показателей может служить, как идентификатор болезни – например, иммуноглобулины и антитела олигоклонального типа в образце могут указывать на наличие или риск развития рассеянного склероза.

• Белок в ликворе: люмбальный – 0,21-0,33 г/литр, вентрикулярный – 0,1-0,2 г/литр.
• Давление в диапазоне 100—200 мм водного ст. (иногда указывают величины 70-250 мм — в странах за пределами постсоветского пространства).
• Глюкоза: 2,70—3,90 ммоль на литр (некоторые источники указывают: две трети от общего количества глюкозы в плазме).
• Хлориды СМЖ: от 116 до 132 ммоль на литр.
• Оптимальными показателями реакции среды считаются значения в пределах 7,310 – 7,330 pH. Изменение кислотности крайне негативно сказывается на выполнении биологических функций, качестве СМЖ и скорости ее протекания по ликворовыводящим путям.
• Цитоз в ликворе: люмбальный – до трех ед. на мкл, вентрикулярный – до одного на мкл.

Чего быть в пунктате здорового человека НЕ должно?

• Антитела и иммуноглобулины.
• Опухолевые, эпителиальные, плазматические клетки.
• Фибриногены, фибриногеновая пленка.

Определяют также и плотность пробы. Норма:

• Общая плотность не должна превышать 1,008 грамм на литр.
• Люмбальный фрагмент – 1,006-1,009 г/л.
• Вентрикулярный фрагмент – 1,002-1,004 г/л.
• Субокципитальный фрагмент – 1,002-1,007 г/л.

Понижаться значение может при уремии, сахарном диабете или менингите, а повышаться – при гидроцефалическом синдроме (увеличении размеров головы вследствие скопления жидкости и ее затрудненного выведения).

Процесс проведения анализа

Обычно для получения образца ликвор берут с помощью поясничной (люмбальной) пункции. Иногда необходимо делать желудочковую (вентрикулярную) или субокципитальную (затылочную) пункцию, однако это бывает нечасто. От типа забора жидкости меняется цена процедуры; стоимость также варьируется в зависимости от места проведения и сложности исследования.

Последовательное описание процедуры, длящейся в среднем 40-50 минут, выглядит следующим образом:

1. Пациент принимает горизонтальное положение и подтягивает ноги к животу, а голову – к груди (при люмбальной пункции). При других видах – лежит или сидит.
2. Нужную зону обрабатывают йодом и спиртом.
3. Для обезболивания в область прокола вводят новокаин.
4. Игла проходит между 3 и 4 либо 5 и 6 позвонком (при поясничной пункции), между височной, теменной и лобной костями при (желудочковой), между вторым шейным позвонком и затылочной костью (при затылочной).
5. Производится забор ликвора. По тому, как жидкость вытекает, можно судить об отклонениях. В норме она выделяется каплями, при увеличении внутричерепного давления бежит стремительно. Для определения давления используют манометр.
6. Игла изымается, зона прокола покрывается стерильной салфеткой.
7. Пациенту на сутки назначается постельный режим.

Полученный ликвор нужно незамедлительно доставить в лабораторию.

Исследование при менингите

Если при исследовании ликвора не обнаружены воспалительные изменения, диагноз менингит исключается. Важным компонентом анализа является плеоцитоз. Мутный ликвор с измененной окраской жидкости (от молочного до зеленоватого) указывает на развитие гнойного менингита. В жидкости преобладают нейтрофилы, что позволяет говорить об остроте воспалительного процесса. Повышен белок, снижен уровень глюкозы. При уменьшении количества нейтрофилов и увеличении лимфоцитов, повышении уровня глюкозы можно говорить о благоприятном исходе заболевания.

При исследовании на туберкулезный менингит бактериоскопический анализ может быть отрицательным. Об этой форме менингита говорит выпадение осадка в ликворе при его отстаивании. В большинстве случаев микобактерии туберкулеза обнаруживаются в осадке, представляющем собой паутинообразную нежную сеточку. Ликвор при туберкулезном менингите не имеет цвета, прозрачен, в плеоцитозе высокий уровень лимфоцитов, в некоторых случаях растет уровень нейтрофилов и лимфоцитов. Неблагоприятный прогноз при увеличении числа макрофагов и моноцитов. При туберкулезном менингите повышен уровень белка, снижен уровень глюкозы, у части больных падает уровень хлоридов.

Менингококковый менингит характеризуется повышением внутричерепного давления, при исследовании ликвора обнаруживается слабовыраженный нейтрофильный цитоз, затем происходят изменения как при гнойном менингите.

Серозный менингит характеризуется прозрачным ликвором, отмечается небольшой плеоцитоз с ростом уровня лимфоцитов. Уровень белка находится в пределах нормы или слегка повышается, у части больных уровень белка может упасть из-за гиперпродукции спинномозговой жидкости. Если в начальной стадии заболевания отмечается плеоцитоз с ростом нейтрофилов, то прогноз заболевания считается неблагоприятным, течение заболевания тяжелым.

Лечение нарушений спинномозгового ликвора

Детские заболевания ликвородинамики чаще всего корректируются фармакотерапией, а вот взрослым требуется назначить физиологические процедуры:

• Курсовый электрофорез с эуфиллином (десять посещений) – лекарственная «подпитка» позволит активизировать доставку кислорода в мозговую ткань, страдающую от гипоксии при повышенном ВЧД. Состояние сосудов приходит в норму, что обеспечит нормальную резорбцию.
• 15 сеансов массажа воротниковой зоны – процедура проста, поэтому со временем больной может и сам проводить подобную манипуляцию. С ее помощью снижается гипертонус мышц, снимается спазм и налаживает отток.
• Магнитное воздействие на воротниковую зону – снижение отечности и сосудистого спазма, улучшение иннервации.
• Лечебное плавание или поддерживающая физ. зарядка.